新型冠狀病毒肺炎病例標本采集與實驗室檢測技術指南

晶科儀器設備

       為指導各級疾控部門和其他相關機構開展病毒肺炎病例標本采集與實驗室檢測工作，特制定本技術指南。 一、標本采集 （一）采集對象。 病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，需要進行病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進一步篩查檢測的環境或生物材料。 （二）標本采集要求。 1.從事病毒檢測標本采集的技術人員應經過生物安全培訓（培訓合格）和具備相應的實驗技能。采樣人員個人防護裝備（Personal Protective Equipment，PPE）要求：N95及以上防護口罩、護目鏡、連體、雙層乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應及時更換外層乳膠手套。 2.住院病例的標本由所在醫院的醫護人員采集。 3.密切接觸者標本由當地指定的疾控機構、醫療機構負責采集。 4.根據實驗室檢測工作的需要，可結合病程多次采樣。 （三）采集標本種類。 每個病例必須采集急性期呼吸道標本（包括上呼吸道標本或下呼吸道標本），重癥病例優先采集下呼吸道標本；根據臨床需要可留取便標本、全血標本、血清標本和尿標本。 標本種類： 1.上呼吸道標本：包括、等。 2.下呼吸道標本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。 3.便標本/肛拭子：留取糞便標本約10克（花生大小），如果不便于留取便標本，可采集肛拭子。 4.血液標本：盡量釆集發病后7天內的急性期抗凝血，采集量5ml，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液。 5.血清標本：盡量釆集急性期、恢復期雙份血清。份血清應盡早（在發病后7天內）釆集，第二份血清應在發病后第3～4周釆集。采集量5ml，建議使用無抗凝劑的真空釆血管。血清標本主要用于抗體的測定，不進行核酸檢測。 6.尿標本：留取中段晨尿，采集量2～3ml。 （四）標本采集和處理。 1.：采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部，一手執拭子，拭子貼鼻孔進入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發生外傷出血。待拭子頂端到達鼻咽腔后壁時，輕輕旋轉一周（如遇反射性咳嗽，應停留片刻），然后緩緩取出拭子，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。 2.：被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤（禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起過敏），被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發“啊”音，露出兩側咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。也可與放置于同一管中。 3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒接在50ml注射器上來替代收集器）。 4.深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的采樣管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前，加入2～3ml采樣液，或加入痰液等體積的痰液消化液。痰液消化液儲存液配方見表1。 表1 痰液消化液儲存液配方 成分 質量/體積 二硫蘇糖醇 0.1g 氯化鈉 0.78g 氯化磷 0.02g  0.112g 磷酸二氫鉀 0.02g 水 7.5ml PH值 7.4±0.2 （25℃） 使用時將儲存液用去離子水稀釋至50 ml，與痰液等體積混合使用，或者參照試劑說明進行使用，也可采用痰液等體積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。 5.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次，也可用小兒接在50ml注射器上來替代收集。 6.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維通過口或鼻經過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣管分支開口，經氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50ml，總量100～250ml，不應超過300ml。 7.糞便標本：取1ml標本處理液，挑取黃豆粒大小的便標本加至管中，輕輕吹吸3-5次，室溫靜置10分鐘，以8000 rpm離心5分鐘，吸取上清液進行檢測。糞便標本處理液可自行配制，配方見表2。 表2 糞便標本處理液配方 成分 質量/體積 Tris 1.211 g 氯化鈉 8.5 g 無水氯化鈣（或含結晶水的氯化鈣） 1.1 g （1.47 g） 水 800 ml 用濃鹽酸調節 pH 為 7.5，以去離子水補充至 1000 ml也可使用HANK’S液或其它等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液溶解便標本制備便懸液。如患者出現腹瀉癥狀，則留取糞便標本3～5ml，輕輕吹打混勻后，以8000 rpm離心5分鐘，吸取上清液備用。 8.肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入3～5cm，再輕輕旋轉拔出，立即放入含有3～5ml病毒保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，棄去尾部，旋緊管蓋。 9.血液標本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液標本5ml，根據所選用的類型確定以全血或血漿進行核酸提取。如需分離血漿，將全血1500～2000rpm離心10分鐘，收集上清于無菌螺口塑料管中。 10.血清標本：用真空負壓采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。 其他材料：依據設計需求規范采集。 （五）標本包裝。 標本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內分裝。 1.所有標本應放在大小適合的帶螺旋蓋內有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。 2.將密閉后的標本裝入密封袋，每袋限一份標本。樣本包裝要求要符合《危險品航空安全運輸技術細則》相應的標準。 3.涉及外部標本運輸的，應根據標本類型，按照A類或B類感染性物質進行三層包裝。 （六）標本保存。 用于病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進行檢測，可在24小時內檢測的標本可置于4℃保存；24小時內無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清標本可在4℃存放3天，-20℃以下可長期保存。應設立專庫或專柜單獨保存標本。 （七）標本送檢。 標本采集后應盡快送往實驗室，如果需要長途運輸，建議采用干冰等制冷方式進行保藏。標本運送期間應避免反復凍融。 1.上送標本 各?。ㄗ灾螀^、直轄市）5例及以上的聚集性病例，以及境外輸入病例的所有原始標本上送中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所進行檢測復核，并附樣本送檢單（見附表）。 2.標本及毒株運輸 2.1 國內運輸 病毒毒株或其它潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應的編號為UN2814，包裝符合國際組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI602分類包裝要求；環境樣本屬于B類，對應的編號為UN3373，包裝符合國際組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI650分類包裝要求；通過其他交通工具運輸的可參照以上標準包裝。 病毒毒株或其它潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規定》（原衛生部令第45號）辦理《準運證書》。 2.2 國際運輸 在國際間運輸的病毒標本或毒株，應規范包裝，按照《出入境特殊物品衛生檢疫管理規定》辦理相關手續，并滿足相關國家和國際相關要求。 2.3 標本和毒株管理 病毒標本及毒株應由專人管理，準確記錄毒株和樣本的來源、種類、數量，編號登記，采取有效措施確保毒株和樣本的安全，嚴防發生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。 二、病毒的實驗室檢測 （一）實時熒光RT-PCR方法檢測病毒核酸。 1.病毒核酸檢測 本指南中的核酸檢測方法主要針對病毒基因組中 開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。 靶標一（ORF1ab）: 正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA 熒光探針（P）： 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3' 靶標二（N）: 正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 熒光探針（P）： 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3' 核酸提取和實時熒光RT-PCR反應體系及反應條件參考相關廠家試劑盒說明。 2.結果判斷 陰性:無Ct值或Ct為40。 陽性：Ct值3.病例確認 實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個： （1）同一份標本中病毒2個靶標（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。如果出現單個靶標陽性的檢測結果，則需要重新采樣，重新檢測。如果仍然為單靶標陽性，判定為陽性。 （2）兩種標本實時熒光RT-PCR同時出現單靶標陽性，或同種類型標本兩次采樣檢測中均出現單個靶標陽性的檢測結果，可判定為陽性。 核酸檢測結果陰性不能排除病毒感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括：樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。 （二）血清抗體檢測。 血清抗體檢測（膠體金、磁微?；瘜W發光、ELISA）用作新9型冠狀病毒核酸檢測陰性病例的補充檢測，在疑似病例診斷中與核酸檢測協同使用，或用于人群血清學調查和既往暴露調查。 實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個： 1.血清病毒IgM和IgG抗體陽性； 2.血清病毒IgG抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期有4倍及以上升高。發病后7天內的急性期抗凝血用于IgM和IgG檢測，如果檢測結果陰性，建議發病后10天內再次采集進行檢測。發病后3-4周恢復期血清用于IgG檢測。如果采用商品化試劑盒，則以廠家明書為準。 三、實驗室活動生物安全要求 根據目前掌握的病毒的生物學特點、流行病學特征、臨床資料等信息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理，具體要求如下： （一）病毒培養。 病毒培養是指病毒的分離、培養、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產生活病毒的重組實驗等操作。上述操作應當在生物安全三級實驗室的生物安全柜內進行。使用病毒培養物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養等同級別的實驗室和防護條件下進行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經培養的感染性材料的防護等級進行操作。實驗室開展相關活動前，應當報經國家衛生健康委批準，取得開展相應活動的資質。 （二）動物感染實驗。 動物感染實驗是指以活病毒感染動物、感染動物取樣、感染性樣本處理和檢測、感染動物特殊檢查、感染動物排泄物處理等實驗操作，應當在生物安全三級實驗室的生物安全柜內操作。實驗室開展相關活動前，應當報經國家衛生健康委批準，取得開展相應活動的資質。 （三）未經培養的感染性材料的操作。 未經培養的感染性材料的操作是指未經培養的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸提取、生化分析，以及臨床樣本的滅活等操作，應當在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護。 （四）滅活材料的操作。 感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進行的核酸檢測、抗原檢測、血清學檢測、生化分析等操作應當在生物安全二級實驗室進行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作，可以在生物安全一級實驗室進行。

9549872678@29

值得收藏