新型冠狀病毒肺炎病例標(biāo)本采集與實驗室檢測技術(shù)指南

晶科儀器設(shè)備

       為指導(dǎo)各級疾控部門和其他相關(guān)機(jī)構(gòu)開展病毒肺炎病例標(biāo)本采集與實驗室檢測工作，特制定本技術(shù)指南。 一、標(biāo)本采集 （一）采集對象。 病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，需要進(jìn)行病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進(jìn)一步篩查檢測的環(huán)境或生物材料。 （二）標(biāo)本采集要求。 1.從事病毒檢測標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)（培訓(xùn)合格）和具備相應(yīng)的實驗技能。采樣人員個人防護(hù)裝備（Personal Protective Equipment，PPE）要求：N95及以上防護(hù)口罩、護(hù)目鏡、連體、雙層乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時更換外層乳膠手套。 2.住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院的醫(yī)護(hù)人員采集。 3.密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)刂付ǖ募部貦C(jī)構(gòu)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。 4.根據(jù)實驗室檢測工作的需要，可結(jié)合病程多次采樣。 （三）采集標(biāo)本種類。 每個病例必須采集急性期呼吸道標(biāo)本（包括上呼吸道標(biāo)本或下呼吸道標(biāo)本），重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本；根據(jù)臨床需要可留取便標(biāo)本、全血標(biāo)本、血清標(biāo)本和尿標(biāo)本。 標(biāo)本種類： 1.上呼吸道標(biāo)本：包括、等。 2.下呼吸道標(biāo)本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。 3.便標(biāo)本/肛拭子：留取糞便標(biāo)本約10克（花生大小），如果不便于留取便標(biāo)本，可采集肛拭子。 4.血液標(biāo)本：盡量釆集發(fā)病后7天內(nèi)的急性期抗凝血，采集量5ml，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液。 5.血清標(biāo)本：盡量釆集急性期、恢復(fù)期雙份血清。份血清應(yīng)盡早（在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，建議使用無抗凝劑的真空釆血管。血清標(biāo)本主要用于抗體的測定，不進(jìn)行核酸檢測。 6.尿標(biāo)本：留取中段晨尿，采集量2～3ml。 （四）標(biāo)本采集和處理。 1.：采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部，一手執(zhí)拭子，拭子貼鼻孔進(jìn)入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發(fā)生外傷出血。待拭子頂端到達(dá)鼻咽腔后壁時，輕輕旋轉(zhuǎn)一周（如遇反射性咳嗽，應(yīng)停留片刻），然后緩緩取出拭子，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。 2.：被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤（禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起過敏），被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。也可與放置于同一管中。 3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒接在50ml注射器上來替代收集器）。 4.深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的采樣管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前，加入2～3ml采樣液，或加入痰液等體積的痰液消化液。痰液消化液儲存液配方見表1。 表1 痰液消化液儲存液配方 成分 質(zhì)量/體積 二硫蘇糖醇 0.1g 氯化鈉 0.78g 氯化磷 0.02g  0.112g 磷酸二氫鉀 0.02g 水 7.5ml PH值 7.4±0.2 （25℃） 使用時將儲存液用去離子水稀釋至50 ml，與痰液等體積混合使用，或者參照試劑說明進(jìn)行使用，也可采用痰液等體積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。 5.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次，也可用小兒接在50ml注射器上來替代收集。 6.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維通過口或鼻經(jīng)過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣管分支開口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50ml，總量100～250ml，不應(yīng)超過300ml。 7.糞便標(biāo)本：取1ml標(biāo)本處理液，挑取黃豆粒大小的便標(biāo)本加至管中，輕輕吹吸3-5次，室溫靜置10分鐘，以8000 rpm離心5分鐘，吸取上清液進(jìn)行檢測。糞便標(biāo)本處理液可自行配制，配方見表2。 表2 糞便標(biāo)本處理液配方 成分 質(zhì)量/體積 Tris 1.211 g 氯化鈉 8.5 g 無水氯化鈣（或含結(jié)晶水的氯化鈣） 1.1 g （1.47 g） 水 800 ml 用濃鹽酸調(diào)節(jié) pH 為 7.5，以去離子水補充至 1000 ml也可使用HANK’S液或其它等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液溶解便標(biāo)本制備便懸液。如患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，則留取糞便標(biāo)本3～5ml，輕輕吹打混勻后，以8000 rpm離心5分鐘，吸取上清液備用。 8.肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入3～5cm，再輕輕旋轉(zhuǎn)拔出，立即放入含有3～5ml病毒保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，棄去尾部，旋緊管蓋。 9.血液標(biāo)本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液標(biāo)本5ml，根據(jù)所選用的類型確定以全血或血漿進(jìn)行核酸提取。如需分離血漿，將全血1500～2000rpm離心10分鐘，收集上清于無菌螺口塑料管中。 10.血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。 其他材料：依據(jù)設(shè)計需求規(guī)范采集。 （五）標(biāo)本包裝。 標(biāo)本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內(nèi)分裝。 1.所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。 2.將密閉后的標(biāo)本裝入密封袋，每袋限一份標(biāo)本。樣本包裝要求要符合《危險品航空安全運輸技術(shù)細(xì)則》相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。 3.涉及外部標(biāo)本運輸?shù)模瑧?yīng)根據(jù)標(biāo)本類型，按照A類或B類感染性物質(zhì)進(jìn)行三層包裝。 （六）標(biāo)本保存。 用于病毒分離和核酸檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測，可在24小時內(nèi)檢測的標(biāo)本可置于4℃保存；24小時內(nèi)無法檢測的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清標(biāo)本可在4℃存放3天，-20℃以下可長期保存。應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为毐４鏄?biāo)本。 （七）標(biāo)本送檢。 標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送往實驗室，如果需要長途運輸，建議采用干冰等制冷方式進(jìn)行保藏。標(biāo)本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。 1.上送標(biāo)本 各省（自治區(qū)、直轄市）5例及以上的聚集性病例，以及境外輸入病例的所有原始標(biāo)本上送中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所進(jìn)行檢測復(fù)核，并附樣本送檢單（見附表）。 2.標(biāo)本及毒株運輸 2.1 國內(nèi)運輸 病毒毒株或其它潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應(yīng)的編號為UN2814，包裝符合國際組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術(shù)細(xì)則》的PI602分類包裝要求；環(huán)境樣本屬于B類，對應(yīng)的編號為UN3373，包裝符合國際組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術(shù)細(xì)則》的PI650分類包裝要求；通過其他交通工具運輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。 病毒毒株或其它潛在感染性材料運輸應(yīng)按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第45號）辦理《準(zhǔn)運證書》。 2.2 國際運輸 在國際間運輸?shù)牟《緲?biāo)本或毒株，應(yīng)規(guī)范包裝，按照《出入境特殊物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定》辦理相關(guān)手續(xù)，并滿足相關(guān)國家和國際相關(guān)要求。 2.3 標(biāo)本和毒株管理 病毒標(biāo)本及毒株應(yīng)由專人管理，準(zhǔn)確記錄毒株和樣本的來源、種類、數(shù)量，編號登記，采取有效措施確保毒株和樣本的安全，嚴(yán)防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。 二、病毒的實驗室檢測 （一）實時熒光RT-PCR方法檢測病毒核酸。 1.病毒核酸檢測 本指南中的核酸檢測方法主要針對病毒基因組中 開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。 靶標(biāo)一（ORF1ab）: 正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA 熒光探針（P）： 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3' 靶標(biāo)二（N）: 正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 熒光探針（P）： 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3' 核酸提取和實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考相關(guān)廠家試劑盒說明。 2.結(jié)果判斷 陰性:無Ct值或Ct為40。 陽性：Ct值3.病例確認(rèn) 實驗室確認(rèn)陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個： （1）同一份標(biāo)本中病毒2個靶標(biāo)（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性。如果出現(xiàn)單個靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測。如果仍然為單靶標(biāo)陽性，判定為陽性。 （2）兩種標(biāo)本實時熒光RT-PCR同時出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，或同種類型標(biāo)本兩次采樣檢測中均出現(xiàn)單個靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，可判定為陽性。 核酸檢測結(jié)果陰性不能排除病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。 （二）血清抗體檢測。 血清抗體檢測（膠體金、磁微粒化學(xué)發(fā)光、ELISA）用作新9型冠狀病毒核酸檢測陰性病例的補充檢測，在疑似病例診斷中與核酸檢測協(xié)同使用，或用于人群血清學(xué)調(diào)查和既往暴露調(diào)查。 實驗室確認(rèn)陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個： 1.血清病毒IgM和IgG抗體陽性； 2.血清病毒IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期有4倍及以上升高。發(fā)病后7天內(nèi)的急性期抗凝血用于IgM和IgG檢測，如果檢測結(jié)果陰性，建議發(fā)病后10天內(nèi)再次采集進(jìn)行檢測。發(fā)病后3-4周恢復(fù)期血清用于IgG檢測。如果采用商品化試劑盒，則以廠家明書為準(zhǔn)。 三、實驗室活動生物安全要求 根據(jù)目前掌握的病毒的生物學(xué)特點、流行病學(xué)特征、臨床資料等信息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進(jìn)行管理，具體要求如下： （一）病毒培養(yǎng)。 病毒培養(yǎng)是指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實驗等操作。上述操作應(yīng)當(dāng)在生物安全三級實驗室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同級別的實驗室和防護(hù)條件下進(jìn)行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的防護(hù)等級進(jìn)行操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當(dāng)報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準(zhǔn)，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。 （二）動物感染實驗。 動物感染實驗是指以活病毒感染動物、感染動物取樣、感染性樣本處理和檢測、感染動物特殊檢查、感染動物排泄物處理等實驗操作，應(yīng)當(dāng)在生物安全三級實驗室的生物安全柜內(nèi)操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當(dāng)報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準(zhǔn)，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。 （三）未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作。 未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作是指未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進(jìn)行的病毒抗原檢測、血清學(xué)檢測、核酸提取、生化分析，以及臨床樣本的滅活等操作，應(yīng)當(dāng)在生物安全二級實驗室進(jìn)行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護(hù)。 （四）滅活材料的操作。 感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測、抗原檢測、血清學(xué)檢測、生化分析等操作應(yīng)當(dāng)在生物安全二級實驗室進(jìn)行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作，可以在生物安全一級實驗室進(jìn)行。

9549872678@29

值得收藏