熒光定量PCR的操作流程

艾美機(jī)械

       1 樣品RNA的抽提
　　①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其溶解。
　　②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
　　③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
　　④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
　　⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
　　⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
　　2 RNA質(zhì)量檢測(cè)
　　1）紫外吸收法測(cè)定
　　先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
　　① 濃度測(cè)定
　　A260下讀值為1表示40 ?g RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 ?g/ml。具體計(jì)算如下：
　　RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495?l的TE中，測(cè)得A260 = 0.21
　　RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l
　　取5ul用來(lái)測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 ?l，剩余RNA總量為：
　　35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g
　　②純度檢測(cè)
　　RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
　　2）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定
　　①制膠
　　1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% (12.3 M)。
　　10×MOPS電泳緩沖液
　　濃度 成分
　　0.4M MOPS，pH 7.0
　　0.1M 乙酸鈉
　　0.01M EDTA
　　灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 ?l溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。
　　②準(zhǔn)備RNA樣品
　　取3?gRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10?g/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
　　③電泳
　　上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。
　　④紫外透射光下觀察并拍照
　　28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。
　　3 樣品cDNA合成
　　①反應(yīng)體系
　　序號(hào) 反應(yīng)物 劑量
　　1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl
　　2 上游引物 0.2μl
　　3 下游引物 0.2μl
　　4 dNTP 0.1μl
　　5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl
　　6 DEPC水 5μl
　　7 RNA模版 2μl
　　8 總體積 10μl
　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
　　②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。
　　③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用

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