熒光定量PCR的操作流程

艾美機械

       1 樣品RNA的抽提
　?、偃龃嬉蚜呀獾募毎覝胤胖?分鐘使其溶解。
　?、趦上喾蛛x 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
　　③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
　?、躌NA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。
　?、軷NA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
　　⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
　　2 RNA質量檢測
　　1）紫外吸收法測定
　　先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
　?、?濃度測定
　　A260下讀值為1表示40 ?g RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 ?g/ml。具體計算如下：
　　RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495?l的TE中，測得A260 = 0.21
　　RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l
　　取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ?l，剩余RNA總量為：
　　35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g
　?、诩兌葯z測
　　RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
　　2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
　?、僦颇z
　　1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% (12.3 M)。
　　10×MOPS電泳緩沖液
　　濃度 成分
　　0.4M MOPS，pH 7.0
　　0.1M 乙酸鈉
　　0.01M EDTA
　　灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 ?l溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
　?、跍蕚銻NA樣品
　　取3?gRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10?g/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
　?、垭娪?br /> 　　上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm。
　?、茏贤馔干涔庀掠^察并拍照
　　28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。
　　3 樣品cDNA合成
　?、俜磻w系
　　序號 反應物 劑量
　　1 逆轉錄buffer 2μl
　　2 上游引物 0.2μl
　　3 下游引物 0.2μl
　　4 dNTP 0.1μl
　　5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl
　　6 DEPC水 5μl
　　7 RNA模版 2μl
　　8 總體積 10μl
　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
　?、诨旌弦涸诩尤肽孓D錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。
　?、廴〕龊罅⒓?5℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用

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